人类行走、呼吸等行为，需要运动神经元的轴突进行超远距离投射（可超过1米），与肌纤维形成突触连接（Neuromuscular junction，NMJ），从而控制骨骼肌收缩和运动。NMJ病变将引起一系列神经肌肉疾病，包括肌萎缩侧索硬化症/渐冻症和重症肌无力等。NMJ突触局部需要大量的信息交换，蛋白质如果在胞体合成通过轴突长距离运输（0.002-4.5 μm/sec），可能需要几个月甚至超过一年才能运输到轴突末端，这很难满足突触局部的即时需求。因此，神经元轴突末端需要预先存储mRNA，在突触局部实时翻译生成蛋白质，这对于突触结构和功能非常重要。目前，对运动神经元NMJ突触局部的蛋白质翻译特征，以及其对运动调节的作用和机制还很不清楚。

2024年8月22日，浙江大学转化医学研究院和医学院附属第一医院沈承勇课题组在Cell Reports杂志上发表了题为“Local protein synthesis at neuromuscular synapses is required for motor functions”的文章，首次建立了在体NMJ局部翻译的研究模型，分析了多时间点突触局部的翻译组信息，揭示NMJ早期关键发育因子Agrin的mRNA（Agrn mRNA）在突触局部存在，并可以局部翻译，影响成年期的运动功能。

在该研究中，为了获取NMJ部位的局部翻译组数据，作者杂交获取了运动神经元的核糖体标签小鼠（ChAT-RiboTag），其可在运动神经元中表达带有HA标签的RPL22。通过免疫荧光染色及免疫电镜，作者确认了HA-RPL22存在于运动神经元胞体及NMJ部位。鉴于膈肌便于观察及操作，作者选定膈肌作为在体研究NMJ局部翻译的模型，并通过翻译中核糖体亲和纯化（Translating Ribosome Affinity Purification，TRAP）的方式获取了小鼠膈肌NMJ四个重要发育时间节点的翻译组数据。

图1：通过TRAP分析体内神经肌肉接头突触翻译组

       作者接下来针对这四个重要发育时间点，对其共性及个性进行了分析。与葡萄糖分解代谢、突触连接和蛋白质稳态相关的蛋白质在各时期的NMJ部位均得到大量局部翻译。同时，相比于运动神经元胞体，NMJ部位局部翻译组的变化更加剧烈，四个发育时间点所富集的局部翻译蛋白其功能相差也较大。

图2：神经肌肉接头突触翻译组分析

有趣的是，作者在翻译组组学数据中发现NMJ早期发育的经典分子凝集素Agrin的mRNA（Agrn mRNA）在成年小鼠的运动神经元轴突末端大量存在。作者通过邻位连接技术（Proximity Ligation Assay，PLA）证实了Agrin在运动神经元轴突末梢的局部翻译。接下来，作者确认了Agrn mRNA的3’UTR不影响其稳定性，但可影响Agrn mRNA在运动神经元轴突末梢的定位，从而影响Agrin蛋白的局部翻译。最后，作者通过原代运动神经元与原代肌管的共培养实验进一步证明了Agrin在运动神经元轴突末梢局部翻译对NMJ形成的重要性。

图3：Agrin在运动神经元轴突末梢发生局部翻译

作者进一步构筑了Agrn 3’UTR在运动神经元中特异缺失的条件型敲除小鼠，用以研究Agrin局部翻译缺失对体内运动功能的影响。行为学显示Agrin局部翻译缺失小鼠的运动能力发生障碍。同时，肌肉电生理实验表明Agrin局部翻译缺失小鼠的NMJ传递功能受损。通过剪断坐骨神经，可发现Agrin局部翻译缺失小鼠肌肉上的乙酰胆碱受体更早出现碎片化，进一步证明Agrin的局部翻译可调控NMJ的结构和功能。

图4：Agrin的局部翻译影响神经肌肉接头信号传递

综上所述，本研究首次开发了在体的NMJ-TRAP局部翻译研究模型。与过去的研究方法相比，此方法可将研究对象集中于外周突触部位，规避了在体研究中神经元胞体及神经突所可能造成的污染，使得局部翻译研究精度更上一个台阶。同时，此研究完整展现了NMJ发育各阶段的局部翻译特征，强调了局部蛋白质合成的时空调节的重要性。此外，以Agrin的局部翻译作为着眼点，该研究确认了成年期Agrin在突触局部的翻译对于NMJ功能的重大意义。最后，此研究所获取的NMJ各阶段局部翻译组数据可作为未来研究的资源，为进一步工作打下基础。

浙江大学转化医学研究院和医学院附属第一医院的沈承勇研究员、张克兢研究员为共同通讯作者。浙江大学博士后杜温佑、博士生许文涛为共同第一作者。本项目也得到南京中医药大学王冰微教授和浙江大学罗本燕教授的大力支持。