AFM丨陈伟/贺永课题组：3D打印多尺度支架协同神经嵴干细胞治疗外周神经损伤
周围神经损伤（peripheral nerve injuries, PNI）是一种常见的临床神经系统创伤。严重的外周神经损伤修复目前仍是神经科学领域的一项艰巨挑战。在周围神经修复过程中，自体神经移植是治疗的金标准，但受到多个限制，包括缺乏足够的供体组织和供体部位的发病率。施旺细胞起到关键性作用并在细胞治疗中被广泛应用，但是自体移植施旺细胞由于获取技术的侵入性、供体部位发病率、细胞数量少等诸多负面因素而受到限制。
近日，浙江大学转化医学研究院/浙江大学医学院附属儿童医院陈伟课题组与浙江大学机械工程学院贺永课题组合作，在Advanced Functional Materials上发表题为“Peripheral Nerve Regeneration with 3D Printed Bionic Scaffolds Loading Neural Crest Stem Cell Derived Schwann Cell Progenitors”的研究论文。该研究以坐骨神经损伤为模型，通过模拟和改善坐骨神经的微环境，利用高精度近场直写打印的仿生支架搭载神经嵴干细胞，探讨了从神经干细胞，支架等多方面进行整体优化而治疗周围神经损伤的策略，系统评估了坐骨神经损伤后功能性的修复。
神经嵴干细胞是周围神经系统细胞的祖先，在体内和体外可以分化为包括施旺细胞在内的周围神经系统的相关细胞，是治疗周围神经损伤中理想的候选细胞。源于自体多种器官和来自人胚胎干细胞的神经嵴干细胞已被用于治疗周围神经损伤，然而，在大多数研究中，细胞移植对周围神经损伤的效果是通过包括神经嵴干细胞在内的混合的细胞群体产生的，无法说明损伤修复的效果源于单一的神经嵴干细胞。到目前为止，只有个别研究阐述了在结合支架的情况下利用纯化的神经嵴干细胞促进了周围神经的修复。
该课题研究人员利用纯化的神经嵴干细胞，经过诱导，其在体外能够分化为施旺细胞，在与背根神经节细胞共培养的过程中，能够形成髓鞘； NCSCs诱导得来的施旺前体细胞移植到坐骨神经截断模型大鼠的损伤区域，该损伤模型得到了一定程度的修复。
然而，单纯的细胞疗法无法很好的模拟和改善天然周围神经微环境，细胞留存率以及细胞和再生轴突的无序排列也会大大降低治疗效率。通过细胞结合支架的手段模拟和改善受损坐骨神经的环境，是周围神经损伤修复中关键的解决策略。
该项目研究人员设计了高孔隙率、高比表面积、兼顾力学支撑及细胞尺度定向结构的多尺度支架结构，负载神经嵴干细胞治疗坐骨神经损伤。该支架采用了可用于临床的聚已内酯材料通过近场直写工艺打印而成，在该支架中，为了诱导施旺前体细胞的定向排列及体内轴突的定向生长，在沿神经方向上排布了支架10微米的定向诱导超细纤维，间距100微米。在垂直神经的方向上，设置了支架60微米的粗纤维，用于支撑起整个支架，维持形貌，为了避免该方向的纤维影响细胞的定向，粗纤维的间距设置为500微米。支架整体具有适宜的孔径和比表面积，有利于物质交换和大量的细胞负载，能够大大提高修复效率（图1）。不同于静电纺丝、光固化打印以及挤出式3D打印这些无法兼顾可控性和精度的支架制造方法，近场直接打印能够制造出直径从几微米至几百微米的纤维，并且结构高度可控，能够实现神经细胞的定向生长及调控。
图1. 搭载NSCPs的3D打印支架的设计
研究者将该3D打印支架与神经嵴干细胞的细胞球共培养于预分化培养基中，7天后，细胞分化为S100β和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）阳性的施旺前体细胞，迁移并覆盖支架上95%以上的纤维，SCPs沿10微米的超细纤维定向迁移并排列，形成类似髓鞘郎飞结的结构，在60微米的粗纤维上贴附大量施旺前体细胞，为沿超细纤维定向迁移的细胞提供存储库。将负载施旺前体细胞的支架卷曲成为直径1.2毫米的柱状结构，实验证明该支架具有大量的细胞负载能力及引导细胞定向迁移的能力（图2）。随后将该支架移植至坐骨神经横断模型大鼠的神经截断部位。由于支架设计的优势和特点，单纯的支架植入实验组，在后期损伤修复的功能测试中，体现出了较高程度的功能恢复。
图2. 近场直写支架形貌及神经干细胞在支架上生长情况
在施旺前体细胞与3D打印材料结合的实验组中，移植5周后，外源细胞在体内分化为施旺细胞（施旺细胞标志物S100β+，P0+），移植10周后，有髓神经及其髓鞘结构、腓肠肌结构、神经电生理和动物步态均明显恢复，且显著优于单纯的细胞移植组和单纯的支架移植组，实验表明支架结合细胞的组合展现出优异的修复效果。该工作提供了坐骨神经损伤修复的系统分析，借助3D打印技术提高干细胞治疗的疗效，全面模拟和改善周围神经的内部受损环境，为组织工程手段治疗周围神经损伤提供了一种新思路，是进行治疗周围神经损伤的重要策略。
该文共同第一作者为浙江大学医学院附属儿童医院李颖，浙江大学机械工程学院博士研究生吕尚及浙江大学转化医学研究院博士研究生袁绘普，浙江大学机械工程学院贺永教授和浙江大学医学院附属儿童医院和转化医学研究院陈伟教授为共同通讯作者。该研究得到了国家973项目，国家自然科学基金面上项目，浙江省重点研发计划、浙江省自然科学基金、厦门双百人才计划的资助。
DOI：10.1002/adfm.202010215
