PARP抑制剂（PARPi）通过合成致死效应选择性杀伤同源重组（Homologous recombination，HR）缺陷的BRCA1突变肿瘤，是靶向精准治疗的经典范例。传统认知中，53BP1通过结合RIF1、招募下游REV7-SHLD1-SHLD2-SHLD3（Shieldin）复合物限制DNA双链断裂（Double strand break，DSB）末端切除，从而拮抗BRCA1、抑制HR并维持BRCA1缺陷细胞的PARPi敏感性。换句话说，Shieldin的生物学功能高度依赖上游53BP1，二者共同构成经典53BP1‑Shieldin 调控轴【1, 2】。

然而多项研究提示该轴并非单一的线性调控模式。例如，53BP1介导的V(D)J重组、基因组稳定性维持以及PTIP依赖的末端切除抑制不需要Shieldin参与【3-5】。敲除53BP1可使exon11缺失的BRCA1突变细胞产生PARPi耐药，但该现象在BRCA1 coiled-coil（CC）结构域、exon5‑13或BRCT结构域缺失的细胞中并不会发生【6-8】。在BRCT结构域缺失的乳腺癌细胞系HCC1937中，53BP1缺失也不能导致PARPi耐药【7】。这些现象提示，Shieldin可能具备独立于53BP1的功能。更重要的是，团队先前发现，BRCA1缺陷肿瘤的特征性突变模式源于DNA复制偶联单末端DSB（single-ended DSB；seDSB）修复紊乱，而非传统认知的双末端DSB（double-ended DSB；deDSB）修复异常【9】。在复制偶联单末端DSB损伤场景下，Shieldin能否绕过53BP1而独立调控DSB修复是一个未回答的核心科学问题。

近日，浙江大学转化医学研究院/医学院附属邵逸夫医院谢安勇/蔡秀军/冯依力团队在Nature Communications杂志上正式发表了题为53BP1-independent Shieldin-BRCA1 antagonism at replication-coupled double-strand breaks的研究论文，系统回答了上述问题。

研究团队首先在BRCA1BRCT结构域缺失（Brca1ΔBT）的小鼠胚胎干细胞中，敲除53bp1和Shld2，检测PARPi敏感性。结果表明仅有Shld2缺失显著推动PARPi（Olaparib）耐药形成，且Shld2的功能可以不需要53bp1存在（图1a，b）。Brca1ΔBT/ΔBT细胞中，Olaparib诱导的辐射状染色体结构在Shld2缺失后明显减少，但53bp1缺失不影响。同时，在BRCA1BRCT缺失型的乳腺癌细胞MDA‑MB436中，利用siRNA干扰或CRISPR/Cas9敲除Shld2，而非53bp1，可促使细胞产生PARPi耐药。反观BRCA1 exon11缺失（Brca1Δ11）细胞，Shld2或53bp1任一基因敲除均可推动耐药形成（图1a，c）。以上结果直接证实：BRCA1 BRCT缺陷背景下，Shieldin独立于53BP1维持PARPi敏感性。

图1. Shieldin独立于53BP1调控Brca1ΔBT/ΔBT细胞的PARPi敏感性。a. Brca1ΔBT/ΔBT和Brca1Δ11/Δ11细胞中敲除53bp1和/或Shld2的WB检测结果。b. Shld2独立于53bp1调控Brca1ΔBT/ΔBT细胞的PARPi敏感性。c. 53bp1/Shld2轴调控Brca1Δ11/Δ11细胞的PARPi敏感性。

为考察Shieldin能否独立于53BP1在Brca1ΔBT/ΔBT细胞中调控DSB修复途径，团队借助姊妹染色单体重组SCR-RFP报告系统，分析经典deDSB（Cas9诱导）与复制偶联seDSB（Cas9D10A/Cas9H840A诱导）的HR修复效率。有趣的是，53bp1缺失显著恢复deDSB的HR效率，对seDSB的HR恢复作用几乎没影响；而Shld2缺失可以特异性恢复seDSB的HR修复水平（图2a）。利用Cas9核酸酶/缺刻酶在内源位点诱导deDSB和seDSB，进一步解析非同源末端连接（non-homologous end joining；NHEJ）效率和接口碱基增删（insertion and deletion；Indel）特征。结果表明，敲除53bp1或Shld2均不影响Brca1ΔBT/ΔBT细胞中deDSB的NHEJ效率，但53bp1缺失或Shld2缺失均可补救突变细胞的末端切除缺陷（图2b，c）。对于复制偶联seDSB，53bp1缺失基本不影响BRCA1缺陷细胞中上升的NHEJ效率和Indel接口删除长度，但Shld2缺失可显著降低BRCA1缺陷细胞中NHEJ效率、缩短Indel接口删除长度（图2b，c）。与之形成对照，在Brca1Δ11/Δ11细胞中，53bp1和Shld2任一缺失均可恢复seDSB的HR效率，抑制seDSB的NHEJ效率并缩短Indel接口删除长度（图2a-c）。这表明在BRCA1 BRCT缺陷下，Shieldin可独立于53BP1调控复制偶联seDSB的修复。

图2. Brca1ΔBT/ΔBT细胞中Shieldin独立于53BP1调控seDSB修复途径。a. 敲除53bp1或Shld2对Brca1ΔBT/ΔBT和Brca1Δ11/Δ11细胞HR修复影响。b. 敲除53bp1或Shld2对Brca1ΔBT/ΔBT和Brca1Δ11/Δ11细胞NHEJ修复影响。c. 敲除53bp1或Shld2对Brca1ΔBT/ΔBT和Brca1Δ11/Δ11细胞Indel接口删除长度影响。

上位效应实验发现，独立于53BP1的Shieldin功能需要通过CST（CTC1–STN1–TEN1）复合物实现。DNA聚合酶a通常在CST下游支持53BP1‑Shieldin 调控轴的功能，但抑制DNA聚合酶a活性则不影响独立于53BP1的Shieldin功能。进一步分析发现：Brca1ΔBT/ΔBT细胞中，Shld2/Shld3缺失更能强有力恢复RAD51焦点，即使在53bp1缺失背景下也能发挥功能（图3）。这提示Shieldin可能在没有53BP1的情况下也能结合末端并发挥作用。为了证明这一猜测，研究者在Brca1ΔBT/ΔBT细胞中构建了ssDNA结合能力缺陷的SHLD2ΔWFG和SHLD2ΔOB1-3内源突变体【10】，这两种突变均产生PARPi耐药并恢复RAD51加载功能，表型与Shld2敲除一致。随后，在敲除Ctc1的Brca1ΔBT/ΔBT细胞中回补CTC1及其突变体，进一步证实CST复合物及其DNA结合能力是Shieldin发挥独立功能的关键。这表明Shieldin-CST可通过其固有的ssDNA结合能力直接作用于已加工的DNA末端，绕过53BP1的招募。为彻底排除53BP1的参与，研究者还在Brca1ΔBT/ΔBTShld3–/–细胞中表达了三个破坏53BP1/RIF1结合的SHLD3点突变体（R171A、W137A、D221A），它们均能恢复Brca1ΔBT/ΔBTShld3–/–细胞的PARPi敏感性并破坏RAD51加载功能，进一步证实Shieldin功能的53BP1独立性。

那么，不依赖53BP1的Shieldin究竟如何抑制RAD51加载的呢？BRCA1缺陷细胞中，RNF168可以帮助RAD51加载，补偿RAD51加载的缺陷，然而，通过破坏RNF168的RAD51互作结构域，研究首先排除了RNF168作为Shieldin拮抗靶点的可能性。BRCA1蛋白缺乏BRCT结构域后出现错误折叠并导致降解，但残留的蛋白依旧保留完整的CC结构域——该结构域通过PALB2-BRCA2负责加载RAD51，是RAD51加载的主要途径【11】。研究者在BRCA1ΔBT基础上进一步敲除CC结构域的关键基序IKL后，Shld2缺失不再能够恢复RAD51焦点或赋予PARPi耐药（图4a-c）。同样，在CC结构域完全缺失的Brca1–/–（exons 5-13缺失）和Brca1ΔCC/ΔCC（CC结构域缺失）突变体中，敲除53bp1或Shld2均无法恢复RAD51焦点或赋予耐药，提示CC结构域完全缺失后，Shieldin丧失了特异性拮抗靶点（图4a-b，d-e）。这表明Brca1ΔBT/ΔBT细胞中，独立于53BP1的Shieldin特异性拮抗靶点是残余的BRCA1 CC结构域活性介导的RAD51加载途径。为了进一步验证该结论，研究者构建了Bard1–/–细胞，该细胞中BRCA1因无法与BARD1结合而发生降解，但残留蛋白仍保留完整的CC结构域。此时Shld2缺失依然赋予PARPi耐药，且53bp1缺失没有影响。反观缺失RING结构域的BRCA1（Brca1ΔRING）细胞中，BRCA1稳定而BARD1降解，此时53bp1或Shld2缺失均可赋予耐药，53BP1非依赖的Shieldin功能被掩盖。上述结果精细界定了独立于53BP1的Shieldin功能发挥的前提：仅当细胞内存在残留的BRCA1 CC结构域介导的RAD51加载活性（即BRCA1水平低或不稳定）时，Shieldin可绕过53BP1进行有效拮抗。

研究总结

该研究首次系统揭示了Shieldin复合体不依赖于53BP1的独立功能，突破了“Shieldin仅是53BP1下游效应器”的传统认知框架。该研究核心发现证实：Shieldin凭借自身和下游因子CST的ssDNA结合能力，直接阻断残余BRCA1 CC结构域介导的RAD51加载。该机制阐明了不同BRCA1突变体呈现PARPi耐药差异性的分子基础，也为PARPi的肿瘤个体化精准治疗提供了一个新的患者分层依据与干预策略。在BRCA1 BRCT截短突变、BARD1缺失或BRCA1启动子高甲基化的肿瘤中，Shieldin通路完整性可能成为更精准的PARPi疗效预测指标；而在BRCA1 exon 11缺失或RING结构域缺失的肿瘤中，经典53BP1-Shieldin轴仍是主导因素。

该研究依赖于本团队于2022年建立的复制偶联DSB定点诱导及修复解析技术体系【9】。这个体系的建立推动了该领域研究范式的革新，已被国际同行广泛应用，极大深化了学界对复制偶联型DSB损伤修复机制的认知，也帮助团队揭示BRCA1缺陷细胞特征性串联倍增（tandem duplication）形成的新机制【12】。

该论文通讯作者是浙江大学医学院附属邵逸夫医院和浙江大学转化医学研究院谢安勇教授、蔡秀军教授和冯依力副研究员。冯依力副研究员和王萌助理研究员是本文共同第一作者。浙江大学医学院湖州医院董顺利研究员也为本研究的开展提供重要支持。

论文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-026-74867-3

参考文献：

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11.Chen, C.C. et al. Homology-directed repair and the role of BRCA1, BRCA2, and related proteins in genome integrity and cancer. Annu Rev Canc Biol2, 313-336 (2018).

12.Huang, Z.C. et al. Late steps of allelic break-induced replication suppress tandem duplication associated with BRCA1 deficiency. Nucleic Acids Res53, gkaf729 (2025).