https://spj.science.org/doi/abs/10.34133/research.0212

蛋白质拟素化（neddylation）是一种类泛素化修饰，由E1-E2-E3酶促级联反应催化完成。哺乳类动物细胞仅有一个拟素化E1， 二个E2s （Ube2m和Ube2f），数10个E3s， 其中Rbx1 E3与Ube2m 配对，催化Cullins 1-4 的拟素化，而Sag/Rbx2 E3 与Ube2f 配对，催化Cullin 5 的拟素化修饰。Rbx1 和Sag 还是Cullin-RING ligases（CRLs）E3泛素连接酶的催化亚基。Cullin的拟素化修饰激活CRLs [1]

孙毅课题组前期工作发现，无论是敲除Rbx1还是Sag，都会导致小鼠胚胎期死亡，且小鼠胚胎存活时间和死因不同 [2, 3]，表明Rbx1和Sag虽然都是含有RING结构的CRLs催化亚基，但功能是相互独立的。孙毅课题组数年前的研究还发现， UBE2M在低氧等刺激情况下会发挥泛素化E2耦联酶的功能，与E3泛素连接酶 Parkin-DJ-1结合，促进UBE2F的泛素化降解 [4]，提示拟素化E2 Ube2m和Ube2f之间在总体功能独立的基础上，也存在一定的关联和相互调控。

调节性T细胞（regulatory T cell，Treg cell）是一类免疫抑制性细胞，与免疫稳态调控及多种免疫相关疾病相关。孙毅课题组去年发表的工作显示：拟素化-CRLs系统的Ube2m-Rbx1轴在调节Treg细胞功能上发挥重要作用，而Ube2f-Sag轴不起作用。因为在Treg细胞中分别敲除Ube2m或Rbx1，均造成Treg细胞免疫抑制功能显著减弱，小鼠出现明显的炎症表型和早期死亡；而分别敲除Ube2f或Sag，均不能引发任何炎症反应，小鼠健康可育 [5]。

本项研究的目的是探索Ube2m-Rbx1和Ube2f-Sag轴之间是否在调节性T细胞中存在功能互补的作用。使用Foxp3-Cre-Loxp系统，繁育产生Foxp3-Cre; Ube2m-fl/fl; Ube2f-fl/fl小鼠，在Treg细胞中同时敲除Ube2m和Ube2f两个拟素化E2s。双敲小鼠出现明显的炎症反应，其生存期仅有35天左右；而在Treg细胞中只敲除Ube2m的小鼠生存期达到4-6个月左右。进一步比较二个E2s双敲的Treg细胞和单敲Ube2m的Treg细胞的转录组变化，发现前者的变化程度（特别是炎症相关通路）远远大于后者。结果表明在Treg细胞中Ube2m缺失的背景下，进一步敲除Ube2f能够增强炎症表型，提示Ube2f本身可以调控Treg细胞功能，但其功能被Ube2m完全补偿了[６]。

课题组进一步研究了E3连接酶Rbx1和Sag的关系。繁育产生Foxp3-Cre; Rbx1-fl/fl; Sag-fl/fl小鼠，在Treg细胞中同时敲除Rbx1和Sag两个E3s。双敲鼠出现明显的炎症反应，强度上与Treg细胞完全缺失的小鼠表型非常接近。在Treg细胞中单敲Rbx1的小鼠炎性表型也十分强烈，与Treg细胞缺失的小鼠表型也非常接近。为了比较Rbx1-Sag双敲鼠与Rbx1单敲鼠的炎症反应进程和程度的区别，课题组进一步对出生仅8天的幼鼠进行比较研究，发现双敲鼠明显比单敲鼠的免疫细胞活化指标更高，说明Treg细胞中同时敲除Rbx1和Sag引发的炎症反应，强于只敲除Rbx1的表型。Rbx1和Sag同时缺失的Treg细胞的转录组变化，也明显强于Rbx1单独缺失的Treg细胞。Treg细胞中Rbx1缺失的背景下，进一步敲除Sag能够增强表型，提示Sag本身也有一定的调控Treg细胞功能；但其功能被Rbx1补偿了[６]。

有趣的是，在Treg细胞中同时敲除Rbx1和Sag两个E3s所引发的表型，明显强于同时敲除Ube2m和Ube2f两个E2s引发的炎症反应。前者Treg细胞的转录组变化也远远多于后者 [６]。因为Rbx1和Sag既是拟素化也是泛素化（通过CRL）修饰的E３连接酶，按照传统观点，拟素化对于下游CRL的功能是必需的 [1]，因此推断 Rbx1/Sag存在不依赖于拟素化的功能，该研究进一步深化了对Rbx1/Sag-CRLs调控机制的理解。

该项工作基于Treg细胞的体内研究，揭示了拟素化-CRLs系统Ube2m-Rbx1和Ube2f-Sag轴之间存在功能补偿作用，同时阐述了Treg细胞中Rbx1/Sag-CRLs存在不依赖于拟素化修饰的功能，并揭示了拟素化-CRLs系统对Treg细胞重要的调控功能和机制。此外，已知CRL的异常与许多人类自身免疫性疾病相关[７]，而CRL的激活需要cullin的拟素化修饰，因此，该项工作对进一步研究自身免疫性疾病的机制和防控手段提供了新的思路和途经。

研究成果于2023年8月3日在Research期刊在线发表。

浙江大学转化医学研究院、浙江大学医学院附属第二医院肿瘤研究所、浙江大学滨江研究院孙毅教授是本文通讯作者，浙江大学医学院附属第二医院肿瘤研究所吴迪特聘研究员是本文第一作者。

研究得到了科技部重点研发计划、国家自然科学基金和浙江省自然科学基金的支持。

参考文献：

1. Zhao,Y., Morgan, M. A. & Sun, Y. Targeting neddylation pathways to inactivate Cullin-RING ligases for anti-cancer therapy. Antioxid. Redox. Signal. 21, 2383-2400 (2014).Zhao, Y. & Sun, Y. Cullin-RING ligases as attractive anti-cancer targets. Curr. Pharm. Des. 19, 3215-3225 (2013).

2. Tan, M., Davis, S. W., Saunders, T. L., Zhu, Y. & Sun, Y. RBX1/ROC1 disruption results in early embryonic lethality due to proliferation failure, partially rescued by simultaneous loss of p27. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 6203-6208 (2009).

3. Tan, M. et al. SAG/RBX2/ROC2 E3 ubiquitin ligase is essential for vascular and neural development by targeting NF1 for degradation. Dev. Cell 21, 1062-1076 (2011).

4. Zhou, W. et al. UBE2M Is a Stress-Inducible Dual E2 for Neddylation and Ubiquitylation that Promotes Targeted Degradation of UBE2F. Mol Cell, 70 (6), 1008–1024 (2018).

5. Wu, D., Li, H., Liu, M., Qin, J., & Sun, Y. The Ube2m-Rbx1 neddylation-Cullin-RING-Ligase proteins are essential for the maintenance of Regulatory T cell fitness. Nature communications, 13 (1), 3021 (2022).

6. Wu, D, and Sun, Y. The functional redundancy of neddylation E2s and E3s in modulating the fitness of regulatory T cells. Research https://spj.science.org/doi/abs/10.34133/research.0212

7. Zhang, X., et al., Advances in the potential roles of Cullin-RING ligases in regulating autoimmune diseases. Front Immunol, 2023. 14: p. 1125224.